Процедура взятие бактериологического образца
Апикальные отверстия всех зубов были закрыты материалом Topdam (FGM, Joinville, SC, Бразилия), чтобы предотвратить просачивание бактерий через апикальное отверстие и создать систему с закрытым концом, которая имитирует эффект паровой пробки. Перед химико-механическим препарированием коронку зуба, включая стенки пульповой камеры, и наружную поверхность корня очищали 3% водородом. перекиси и дезинфицируют 2,5% раствором NaOCl. Последний затем инактивировали 10% тиосульфатом натрия. Эту процедуру проводили стерильными ватными тампонами и стерильными бумажными штифтами, смоченными растворами. Образец для контроля стерильности (отрицательный контроль) брали с внутренних поверхностей доступа.
Полости с помощью стерильных бумажных штифтов, которые были помещены в трис-ЭДТА-буфер (10 ммоль/л Трис-HCl и 1 ммоль/л ЭДТА, рН 5−7,6), а затем обработаны и проанализированы так же, как описано для образцов корневых каналов.
Внутриканальные бактериологические пробы были взяты до (S1) и после препарирования корневого канала (S2). Корневой канал сначала промывали 1 мл стерильного 0,85% физиологического раствора для удаления непривязанных бактериальных клеток, и отбирали начальную пробу путем последовательного использования 3−5 бумажных штифтов, расположенных на расстоянии 1 мм от Длина проходимости. Эта мера была определена как рабочая длина (WL). Каждую бумажный штифт оставляли в канале на 1 минуту, удаляли и помещали в колбы, содержащие 1 мл Трис-ЭДТА-буфера. Образцы немедленно замораживали при 220 °C до извлечения ДНК и анализа qPCR.
Химико-механическая подготовка
Все процедуры были выполнены одним и тем же оператором, опытным эндодонтистом, который не знал внутренней анатомии, выявленной с помощью микро-КТ. Зубы были распределены на 2 группы по 30 в каждой, одну с узкими полостями доступа, другую с обычными полостями.
Препарирование проводилось одинаково во всех каналах 2-х групп с использованием инструмента XP-endo Shaper (FKG Dentaire). Первоначально канал был промыт 2 мл NaOCl в течение 30 секунд, и с помощью ручного файла типа K размером 15 была создана «ковровая дорожка» к WL. 1 Нсм в течение 10 секунд возвратно-поступательными движениями с амплитудой 3−4 мм до рабочей длины. Инструмент извлекали из канала, очищали стерильной марлей и проводили промывание 2 мл NaOCl в течение 30 секунд. Ручной файл К-типа размером 15 использовался для проверки и поддержания проходимости корневого канала при каждом извлечении инструмента XP-endo Shaper. Далее инструмент XP-endo ShaperTM использовался дважды, как описано (всего 3 цикла по 10 секунд каждый на РУ). После последнего цикла канал промывали 2 мл NaOCl в течение 30 секунд, 5 мл 17% ЭДТА в течение 30 секунд и 2 мл NaOCl в течение 30 секунд. Окончательную промывку 1 мл 10% тиосульфата натрия в течение 1 минуты выполняли для инактивации NaOCl и брали бактериологический образец S2, как описано ранее. Было выполнено новое микро-КТ сканирование.
Каждый инструмент использовался для подготовки 3 корневых каналов. Иглы NaviTip (30 г) использовались для всех процедур орошения. Иглы размещали на расстоянии 3 мм от WL. Ирригационная игла была соединена с ирригационным насосом Vatea (ReDentNOVA, Ra’anana, Израиль) для управления потоком поливной жидкости.
В обеих группах общий объем ирригатора, используемого на канал, составлял 10 мл 2,5% NaOCl и 5 мл 17% EDTA. Все процедуры проводились в строгих асептических условиях в камере ультрафиолетового стерилизатора с внутренней температурой, поддерживаемой на уровне 37 °C с помощью нагревателя (800-Heater; PlasLabs, Lansing, MI)
Все ирриганты также предварительно нагревали на водяной бане до 37 °C.
Молекулярно-микробиологический анализ
Мини-набор ДНК QIAamp (Qiagen, Валенсия, Калифорния) использовался для извлечения ДНК из бактериологических образцов (контроль стерильности, S1 и S2) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Общие уровни E. faecalis определяли количественно с помощью анализа qPCR на основе гена 16S рибосомной РНК с использованием специфической пары праймеров для этого вида19.
Анализ qPCR проводили с использованием Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Фостер-Сити, Калифорния) на приборе для ПЦР в реальном времени ABI 7500 (Thermo Fisher Scientific) в общем реакционном объеме 20 мл, содержащем каждый праймер в концентрации 0,5 ммоль/л и 2 мл Извлечение ДНК из каждого образца.
Реакция qPCR была такой, как описано ранее 20. Вкратце, условия циклирования температуры включали начальный этап при 95 °C в течение 10 минут, за которым следовали 40 циклов при 95 °C в течение 1 минуты, 60 °C в течение 1 минуты и 72 °C в течение 1 минуты. Накопление продуктов полимеразной цепной реакции измеряли в каждом цикле.
Отрицательный контроль, не содержащий ДНК-матрицы, подвергали тем же процедурам. Оценки проводились в трех экземплярах для образцов, стандартов и контрольных образцов.
Анализ кривой плавления продуктов полимеразной цепной реакции проводили после амплификации для подтверждения специфичности метода.
Сбор и анализ данных проводились с использованием программного обеспечения ABI 7500 версии v2.0.4 (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния). E. количество фекалий определяли на основе стандартной кривой, построенной с использованием экстрактов ДНК из известных концентраций E. faecalis ATCC 29 212, которые были 10-кратно разведены от 107 до 102 клеток в буфере Трис-ЭДТА и использованы для построения кривой.
Бактериологические образцы были взяты из 2 групп в 2 временных точках.
Многоуровневые регрессионные модели Пуассона были приспособлены к данным подсчета бактерий, чтобы учесть чрезмерную дисперсию данных и тот факт, что эти данные были сгруппированы на индивидуальном уровне. Коэффициенты заболеваемости были получены из моделей и описывали внутригрупповые и межгрупповые изменения количества бактерий после лечения. Анализы проводились в программном обеспечении StataSE 15 (StataCorp, Station College, TX).
Данные по бактериальному наличию/отсутствию после лечения сравнивали с помощью критерия хи-квадрат с коррекцией Йейтса с использованием программного обеспечения STATISTICA v8.0 (StatSoft, Tulsa, OK).
Для микро-КТ-анализа неподготовленных участков поверхности нормальность количественных переменных была проверена с помощью теста Колмогорова-Смирнова и графического анализа.
Для внутри- и межгрупповых сравнений, связанных с общей длиной корневого канала (10 мм), t-критерий Стьюдента был применен к данным об объеме и поверхности корневого канала (исходной и конечной), а также к количеству не препарированных участков.
Когда апикальный 4-мм сегмент канала оценивался отдельно, для межгруппового анализа использовался непараметрический критерий Манна-Уитни, а для внутригруппового анализа — критерий Уилкоксона. Программное обеспечение SPSS (Statistical Package for Social Sciences 21.0; IBMt Corp, Armonk, NY) использовалось для анализа данных микро-КТ с уровнем значимости, установленным на уровне 5%.