Биопленки и апикальный периодонтит: изучение распространенности и связи с клиническими и гистопатологическими данными

Резюме
Введение: В этом исследовании оценивалась распространенность бактериальных биопленок в необработанных и обработанных корневых каналах зубов, свидетельствующих об апикальном периодонтите. Также были исследованы связи биопленок с клиническими состояниями, рентгенологическим размером и гистопатологическим типом апикального периодонтита.

Методы: Материал включал образцы биопсии 106 корней зубов с апикальным периодонтитом (64 необработанных и 42 обработанных). Образцы были получены с помощью апикальной хирургии или удаления и обработаны для проведения гистопатологических и гистобактериологических исследований.

Выводы: В целом полученные данные соответствуют приемлемым критериям для включения апикального периодонтита в группу заболеваний, вызываемых биопленками. Морфологическая структура биопленок варьировала от случая к случаю, и не было выявлено какой-либо уникальной картины эндодонтических инфекций. Биопленки, скорее всего, присутствуют в связи с длительными патологическими процессами, включая крупные поражения и кисты.

Результаты: Бактерии были обнаружены во всех образцах, кроме одного. В целом, в апикальном сегменте 77% корневых каналов были обнаружены внутрирадикулярные биопленки (необработанные каналы: 80%; обработанные каналы: 74%). Были также замечены биопленки, покрывающие стенки ответвлений и перешейков. Бактериальные биопленки были обнаружены в 62% и 82% корневых каналов зубов с мелкими и крупными рентгенологическими дефектами соответственно. Во всех каналах с очень крупными повреждениями были обнаружены внутрирадикулярные биопленки. Биопленки были в значительной степени связаны с эпителизированными поражениями (кистами и эпителизированными гранулемами или абсцессами) (р < 0,001). Общая распространенность биопленок в кистах, абсцессах и гранулемах составила 95%, 83% и 69,5% соответственно. Не было обнаружено корреляции между биопленками и клиническими симптомами или наличием свищевого хода (p > 0,05). Экстрарадикулярные биопленки наблюдались только в 6% случаев.

Хотя на основе этих наблюдений была разработана концепция апикального периодонтита как заболевания, вызываемого биопленками, о распространенности биопленок и их связи с клиническими и гистопатологическими данными пока не сообщалось. До того, как эта информация станет доступной, не совсем корректно обобщать и классифицировать апикальный периодонтит как заболевание, вызываемое биопленкой. Цель настоящего исследования состояла в двух аспектах: (1) оценить распространенность внутрирадикулярных и экстрарадикулярных бактериальных биопленок в необработанных и обработанных корневых каналах зубов человека, свидетельствующих об апикальном периодонтите, с помощью гистобактериологического подхода и (2) выявить связь биопленок с некоторыми клиническими состояниями, рентгенологическим размером и гистопатологическим типом апикального периодонтита.

Ключевые слова: Апикальный периодонтит, бактериальная биопленка, эндодонтическая инфекция, эндодонтическое лечение

В своей естественной среде обитания микроорганизмы почти всегда живут как члены метаболически интегрированных сообществ, обычно прикрепляющихся к поверхностям с образованием биопленок. Образ жизни сообщества биопленок предоставляет микроорганизмам ряд преимуществ, которые не наблюдаются у отдельных клеток, живущих в свободноплавающем (планктонном) состоянии, включая создание более широкой среды обитания для роста; повышение метаболического разнообразия и эффективности; защиту от конкурирующих микроорганизмов, защитных сил организма, антимикробных средств и экологического стресса и повышенной патогенности. Изучение микробных биопленок приобретает большое значение в различных направлениях промышленной, экологической и медицинской микробиологии. В медицинской микробиологии биопленки все чаще изучаются, и оценки показывают, что инфекции, вызываемые биопленками, составляют от 65% до 80% всех случаев инфицирования в развитых странах мира. Что касается полости рта, то кариес, гингивит и пародонтит являются примерами заболеваний, вызываемых бактериальными биопленками в виде наддесневого или поддесневого зубного налета. Все больше данных указывает на то, что апикальный периодонтит также является заболеванием, вызванным биопленкой. Исследования in situ с использованием оптической и/или электронной микроскопии позволили наблюдать бактерии, колонизирующие систему корневых каналов при первичных или персистирующих/вторичных инфекциях, в виде неподвижных биопленок, покрывающих стенки дентина. Было показано, что апикальные ответвления, боковые каналы и перешейки, соединяющие основные корневые каналы, содержат бактериальные клетки, которые также часто организованы в биопленкоподобные структуры. Кроме того, сообщалось о биопленках на апикальной поверхности корня (экстрарадикулярные биопленки), которые рассматриваются как возможная причина апикального периодонтита после лечения.

Клинические образцы
Материалом для данного исследования послужили материалы биопсии корней или верхушек корней вместе с окружающими очагами апикального периодонтита. Образцы были частью гистологической подборки одного из авторов (доктор медицинских наук). Материал состоял из 106 корней 100 человеческих зубов. Из них 58 были зубами с необработанными корневыми каналами (6 резцов, 3 клыка, 18 премоляров и 31 коренной зуб) у 52 пациентов (25 женщин, 27 мужчин) в возрасте от 18 до 75 лет (в среднем 42 года). В общей сложности было получено 64 корня необработанных зубов, из которых 59 были удалены с присоединенными очагами апикального периодонтита, в то время как в остальных пяти образцах очаги удалялись отдельно.

Все необработанные зубы имели некротизированную пульпу и серьезные кариозные поражения и были удалены, поскольку были признаны неизлечимыми или пациент не согласился сохранить зуб. Были составлены отчеты о любых симптомах, которые пациент испытывал в связи с пораженным зубом. Также регистрировалось наличие/отсутствие свищевого хода. Для 33 зубов перед удалением были сделаны периапикальные рентгенограммы и измерен наибольший диаметр периапикальной области. Зубы с пародонтальными карманами, продольными переломами или трещинами, затрагивающими корень, были исключены из анализа. Некоторые из исследованных зубов были включены в предыдущие исследования.

Обработка тканей
Сразу после удаления (с помощью периапикальной хирургии или удаления) биоптат помещали в 10%-ный формалин с нейтральным буфером как минимум на 48 часов. Деминерализацию проводили в водном растворе, состоящем из смеси 22,5% (по объему) муравьиной кислоты и 10% (по массе) цитрата натрия, в течение 3-4 недель, конечную точку определяли рентгенологически. Все образцы промывали в проточной водопроводной воде в течение 24-48 часов, обезвоживали в этаноле с повышением концентрации, очищали в ксилоле, пропитывали и заливали в парафин (температура плавления 56°C) в соответствии со стандартными процедурами. Для получения срезов, параллельных длинной оси корневого канала, были приняты особые меры предосторожности. Корни многокорневых зубов были удалены и обработаны отдельно. Если корни были изогнуты, их разделяли на две части: две трети коронки, и одну треть верхушки. С помощью микротома, установленного на расстоянии 4-5 мм, были сделаны продольные срезы до тех пор, пока каждый образец не был исчерпан. Для некоторых образцов были сделаны поперечные срезы. Каждое пятое предметное стекло окрашивали гематоксилин-эозином в целях скрининга и оценки воспаления. Для выбранных предметных стекол использовали модифицированную методику Брауна и Бренна для окрашивания бактерий. Точность метода бактериального окрашивания была проверена с использованием протокола, описанного Рикуччи и Бергенхольц.

42 биопсии корней/верхушек корней зубов с обработанными корневыми каналами были взяты у 42 пациентов, 24 из которых (12 с симптомами и 12 без симптомов) приняли участие в недавней публикации и были повторно оценены в этом исследовании на наличие биопленок в соответствии с установленными здесь параметрами (см. далее). Все 42 случая были классифицированы как неудачные на основании клинических и/или рентгенологических наблюдений, после минимального периода отзыва в 4 года для бессимптомных случаев и 1 года для симптоматических. В 10 из новых случаев качество проведенного ранее эндодонтического лечения было оценено как неудовлетворительное. В четырех из 18 новых случаев рентгенограммы были недоступны. Все пациенты дали согласие на обследование своих зубов.

Статистический анализ
Точный критерий Фишера или критерий хи-квадрат был использован для проверки связи внутрирадикулярных биопленок со следующими параметрами: рентгенологический размер очагов апикального периодонтита (сгруппированных в очаги поражения ≤ 5 мм и >5 мм), общий гистологический тип апикального периодонтита (гранулемы, кисты и абсцессы без различия подтипов), наличие или отсутствие пролиферации эпителия (независимо от типа поражения), состояние придаточных носовых пазух и симптомы. В каждом анализе учитывались только необработанные корневые каналы, только обработанные каналы и все образцы вместе взятые. Распространенность биопленок в необработанных и обработанных зубах также сравнивалась с помощью критерия хи-квадрат.

Критерии оценки
Слайды были просмотрены двумя экспертами. Оценки проводились по отдельности, и в случае возникновения разногласий они решались путем совместного обсуждения. Особое внимание было уделено следующим аспектам при обследовании необходимо обратить внимание на: 1) наличие и локализацию бактерий в апикальном сегменте корневого канала, включая основной канал, боковые каналы, апикальные ответвления и перешейки (внутрирадикулярная инфекция) или внутри очага поражения апикальным периодонтитом, или на наружной апикальной поверхности корня (экстрарадикулярная инфекция). Параметр, используемый для классификации структур бактериального сообщества как биопленок, соответствует определению биопленки, данному Холлом-Стандли и соавторами: ‘Микробные биопленки - это популяции микроорганизмов, которые сосредоточены на границе раздела и обычно окружены матрицей внеклеточного полимерного вещества’. Также, согласно этим авторам, скопления или коагрегаты бактериальных клеток, которые, по-видимому, не прикреплены к поверхности, были классифицированы как ‘хлопья’. Наличие и распределение клеток острого и хронического воспаления и эпителия в воспаленных периапикальных тканях (гистологически поврежденных) диагностировались следующим образом: апикальный абсцесс (эпителизированный или неэпителизированный), гранулема (эпителизированная или неэпителизированная) или киста (истинная, карманная или неклассифицированная; последний диагноз был поставлен, когда при поражении обнаруживалась полость, выстланная эпителием, но мягкие ткани не оставались прикрепленными к верхушке корня и их приходилось удалять отдельно).

Общая распространенность биопленки
Бактерии были обнаружены во всех образцах, за исключением одного бессимптомного зуба с обработанным корневым каналом, у которого заболевание возникло, вероятно, из-за реакции на инородное тело. Об этом случае сообщалось в предыдущем исследовании. В целом, бактериальные скопления в виде внутрирадикулярных биопленок наблюдались в апикальном сегменте 82 из 106 (77%) корневых каналов. Из них 51 из 64 (80%) были из необработанных каналов, а 31 из 42 (74%) - из обработанных (таблица 1). Это различие не было статистически значимым (Х2, p = 0,6).

Рисунок 1. Примеры внутриканальных биопленок с различной морфологией бактериальных клеток. (а) Преобладание кокков. Обратите внимание на высокую концентрацию клеток, контактирующих со стенками корневого канала (модифицированный метод Тейлора Брауна и Бренна, оригинальное увеличение в 1000 раз). (b) Преобладание нитевидных форм. Обратите внимание на неравномерное распределение бактериальных клеток во внеклеточном материале (исходное увеличение в 1000 раз).

Морфологическое описание бактериальной колонизации
Внутрирадикулярные бактериальные биопленки обычно толстые и состоят из нескольких слоев бактериальных клеток. При большом увеличении в большинстве случаев можно различить три основные морфологии бактериальных клеток: кокки, палочки и нити (рис. 1a и b, 2c и d, 3c и d, 4d и 5c и d). Эти морфотипы часто присутствовали вместе в различных пропорциях в одной и той же биопленке. Однако, по-видимому, в каждой биопленке доминировал один морфотип (рис. 1a и b, 2c и d, 3c, 4d и 5c и d).

В структуре биопленки соотношение между бактериальными клетками и внеклеточным матриксом сильно варьировало. В некоторых случаях бактериальные клетки оказывались настолько слипшимися, что внеклеточный компонент был практически не виден (рис. 2d и 5c и d). В других случаях внеклеточный матрикс был в изобилии, а бактериальных клеток было меньше, и они были распределены неравномерно (рис. 1a и b, 2c, 3c и 4c и d). Во многих биопленках клетки были в изобилии обнаружены в самых глубоких слоях (рис. 1а и 4с). Однако в некоторых других случаях они были распространены в самых поверхностных слоях.

Во многих образцах многослойные биопленки равномерно покрывали стенки корневого канала на большом протяжении. В некоторых случаях противоположные стенки корневого канала, покрытые биопленками, были покрыты некротическими остатками или воспалительными клетками в просвете канала (рис. 3b и 5b). В зубах с выраженным кариесом и длительным некрозом пульпы нередко можно было наблюдать, что весь канал в апикальной трети был заполнен плотной биопленкой. Однако в некоторых случаях, несмотря на то, что некоторые участки канала были полностью покрыты биопленкой, другие, по-видимому, были свободны от бактериальной колонизации (рис. 2g). Такая картина чаще наблюдалась в обработанных корневых каналах, но также наблюдалась и в нескольких необработанных образцах.

В некоторых случаях бактериальная колонизация ограничивалась поверхностью стенки корневого канала, и глубокой инвазии в дентин не наблюдалось. Вероятно, это было связано с уменьшенным количеством и малым диаметром или даже отсутствием дентинных канальцев в определенных областях апикального сегмента корня (рис. 1a и b, 2c и d, а также 3c). Однако, когда дентинные канальцы присутствовали в большом количестве, они обычно оказывались заселенными бактериями, распространяющимися из биопленки и проникающими на различную глубину (рис. 6 a и b).

Рисунок 2. (а) Моляр нижней челюсти с разрушенной в результате обширного кариозного процесса коронкой и дефектом вокруг мезиального корня более 5 мм. За предыдущие месяцы произошло несколько обострений, но на момент удаления зуб был бессимптомным. (b) Срезы были сделаны в мезиодистальной плоскости. Разрез проходит через апикальную треть мезиально-щечного канала. Просвет частично заполнен крупными телами, окрашенными фуксином, вероятно, остатками пищи (крупные растительные клетки). Ближе к апикальной части стенки корневого канала казались покрытыми плотной бактериальной биопленкой (модифицированная Брауном и Бренном по методу Тейлора, первоначальное увеличение 100). (c) Большое увеличение области стенки корневого канала, обозначенной стрелкой влево на рисунке b. Преобладающим морфотипом бактерий на этом уровне являются палочки (первоначальное увеличение1000). (d) Большое увеличение области стенки корневого канала, обозначенной стрелкой вправо на рисунке b. Высокая плотность бактериальной популяции, по-видимому, скрывает внеклеточный матрикс. Обратите внимание на полиморфноядерные нейтрофилы, контактирующие с поверхностью биопленки (исходное увеличение 1000). (д) Поперечный срез, сделанный на границе между апикальной и средней третью мезиального корня. На снимке с небольшим увеличением видно, что два мезиальных канала соединены широким перешейком, забитым бактериями (первоначальное увеличение 8). (f) Подробное изображение перешейка. Его просвет заполнен плотной биопленкой (исходное увеличение 100). (g) Изображение корневого канала на рисунке е. большая часть окружности корневого канала покрыта бактериальной биопленкой (исходное увеличение 100).

В одном из необработанных зубов наблюдалась необычная внутриканальная бактериальная колонизация, которая заслуживает более подробного описания. Это первый премоляр верхней челюсти у мужчины 58 лет. Пациент жаловался на несколько приступов боли, и зуб, который был признан невосстановимым из-за сильного разрушения коронковой части, был удален. Срезы, проходящие через щечный канал, показали, что просвет апикального канала был забит некротическими остатками и бактериями (рис. 7а). В центре основного корневого канала находилось большое скопление бактерий, состоящее из разветвленных нитевидных бактериальных клеток и окруженное отчетливым слоем аморфного материала (рис. 7b-d). Бактерии казались особенно концентрированными в этой структуре, и на периферии они имели вид звездочек, типичный для колоний актиномикозов (рис. 7в и г). Серийные срезы показали, что эта крупная колония не прилегала к стенкам корневого канала. На самом деле, она, по-видимому, свободно плавала в просвете корневого канала, смешавшись с остальным содержимым канала. Этот случай был оценен как свидетельствующий о наличии биопленки, но не из-за необычно крупных хлопьев, взвешенных в канале, которые, согласно используемым здесь критериям определения, не могут быть строго отнесены к биопленке, а скорее потому, что бактериальные скопления, присутствующие в большей степени на верхушке, были четко прикреплены к стенкам корневого канала, образуя биопленкоподобный слой (рис. 7б).

Связь с различными заболеваниями
Для проверки связи между внутрирадикулярными биопленками и размерами апикального периодонтита были использованы рентгенограммы 71 образца. Бактериальные биопленки были обнаружены в 23 из 37 образцов (62%) корневых каналов с небольшими дефектами (менее 5 мм), тогда как в образцах с большими повреждениями (>5 мм) биопленочные структуры присутствовали в 28 из 34 (82%) (таблица 2). Статистический анализ выявил значение p, очень близкое к используемому уровню значимости (x2, p = 0,059). В частности, в необработанных каналах распространенность внутрирадикулярных биопленок составила 59% и 87,5% в образцах с мелкими и крупными дефектами соответственно. Биопленки на обработанных зубах были обнаружены в 65% и 78% каналов с мелкими и крупными дефектами соответственно. Все пять каналов, связанных с поражениями внутрирадикулярные биопленки размером более 10 мм были покрыты ими (таблица 2).

Также были обнаружены биопленки, покрывающие стенки апикальных ответвлений, боковых каналов и перешейков как в необработанных, так и в обработанных каналах. В некоторых необработанных каналах бактерии в виде биопленок или хлопьев не достигали апикального отверстия, поскольку в апикальной трети корневого канала наблюдалась витальная воспаленная ткань. В этих случаях очаг инфекции располагался в нескольких миллиметрах от отверстия. Мелкие бактериальные хлопья и планктонные клетки были обнаружены практически во всех образцах, включая те, которые были отрицательными на наличие биопленок. В просвете основного канала, разветвлениях и перешейках обычно наблюдались хлопья и планктонные клетки, которые либо явно плавали, либо, чаще всего, были опутаны некротизированной тканью пульпы.

Что касается гистопатологического диагноза, то внутрирадикулярные биопленки были в значительной степени связаны с эпителизированными поражениями (кистами и эпителизированными гранулемами или абсцессами) (критерий Фишера, p < 0,001). Из 30 поражений, демонстрирующих пролиферацию эпителия, 28 (93%) были связаны с внутрирадикулярными биопленками. Хотя в каналах, ассоциированных с эпителизированными или неэпителизированными гранулемами, внутрирадикулярные биопленки обнаруживались в 86% и 67% случаев соответственно, эта разница в 20% не достигала значимости для оцениваемого размера выборки (критерий Фишера, р = 0,4). Когда поражения были сгруппированы в гранулемы (эпителизированные или нет), абсцессы (эпителизированные или нет) и кисты (истинные, очаговые и неклассифицированные), внутрирадикулярные биопленки обнаруживались значительно чаще в кистах, чем в гранулемах (критерий Фишера, р = 0,03).

Рисунок 3. Сильно пораженный кариесом однокорневой второй моляр нижней челюсти, удаленный с присоединенным очагом апикального периодонтита. Рентгенологический размер очага составил <5 мм. Состояние зуба было симптоматичным. (а) Разрез, проходящий приблизительно по центру апикального отверстия. На снимке видно гранулематозное разрастание ткани в апикальной трети (модифицированный метод Тейлора, Брауна и Бренна, оригинальное увеличение в 16 раз). (б) Детали области апикального отверстия. Стенки корневого канала покрыты биопленкой, а плотное скопление бактерий более заметно в коронковой области. Пустые пространства - это следы артефактов (первоначальное увеличение 100). © Увеличение области, очерченной прямоугольником на рисунке b. Преобладают нитевидные формы бактерий, и на этом уровне в изобилии присутствует внеклеточный компонент (исходное увеличение 400). (d) Большее увеличение скопления бактерий показано стрелкой в b. Присутствуют различные морфотипы. Обратите внимание на концентрацию полиморфноядерных нейтрофилов в контакте с поверхностью биопленки (исходное увеличение 400).

Рисунок 4. (а) Второй премоляр верхней челюсти с периапикальной рентгенопрозрачностью, диаметр которой был измерен как >5 мм. Зуб был удален при наличии клинических симптомов (боли и припухлости). (б) Очаг апикального периодонтита остался прикрепленным к верхушке корня. Разрез, проходящий через основное широкое апикальное отверстие (модифицированный метод Тейлора, Брауна и Бренна, оригинальное увеличение в 16 раз). (в) Подробный снимок области отверстия. В самой верхней части канала, окруженной воспалительной тканью, присутствует биопленка. Обратите внимание на рассасывание стенок канала (первоначальное увеличение 100). На вставке показаны Пполиморфноядерные нейтрофилы из центра дефекта, в одном из которых видна цитоплазма, заполненная несколькими бактериальными фрагментами (первоначальное увеличение 1000). (d) Увеличение участка на фрагменте цемента, обозначенного стрелкой в). На этом уровне преобладают нитевидные формы бактерий. Биопленка окружена полиморфноядерными нейтрофилами (первоначальное увеличение 400).

На самом деле, только у одного из 20 (5%) кистозных образований не было выявлено наличия внутрирадикулярных биопленок. Других значимых различий по типам образований не наблюдалось (p > 0,05). Общая распространенность биопленок в гранулемах составила 41 из 59 случаев (69,5%), а при абсцессах - у 20 из 24 (83%). В целом, результаты отдельного анализа необработанных каналов были аналогичны общим выводам. Поскольку кисты не наблюдались в связи с лечением корневых каналов зубов, статистический анализ данных по обработанным каналам отдельно не проводился.

Внутрирадикулярные биопленки были обнаружены в семи из восьми (87,5%) случаев в образцах, связанных с носовыми пазухами, и в 57 из 69 (83%) случаев с симптомами (таблица 1). Однако, несмотря на высокую распространенность, эти значения не были статистически значимыми по сравнению со случаями без свищевого хода (75/98, 76,5%) (критерий Фишера, р = 0,7) и без симптомов (25/37, 68%) (c2, 0,08). Не было обнаружено значимости данных по необработанным и обработанным каналам при раздельном анализе (p > 0.05).

Рисунок 5. (а) Второй премоляр нижней челюсти, удаленный после нескольких эпизодов боли. При удалении очаг апикального периодонтита остался прикрепленным к верхушки корня. Участок, проходящий примерно по центру корневого канала. На снимке видна значительная резорбция верхушки корня. Канал, по-видимому, заполнен тканью, а на противоположных стенках корневого канала имеются две бактериальные массы (модифицированные по методу Тейлора Браун и Бренна, оригинальное увеличение в 16 раз). (б) Более высокое увеличение апикальной трети канала. Бактериальные массы представляли собой биопленочные структуры. Просвет канала заполнен воспалительными клетками (исходное увеличение 100). (в и d) Более высокое увеличение левой и правой биопленочных структур соответственно. Обе они, по-видимому, состояли исключительно из бактериального нитевидного морфотипа. Эти бактериальные биопленки были окружены сильной воспалительной реакцией (первоначальное увеличение 400).

Экстрарадикулярные бактериальные биопленки были обнаружены только в шести образцах (6%), четыре из необработанных каналов и два из обработанных. Все эти образцы были связаны с клиническими симптомами. Из восьми случаев со свищевыми ходами внерадикулярные биопленки были обнаружены в трех (37.5%). Во всех случаях, кроме одного, экстрарадикулярная биопленка была связана с внутрирадикулярной биопленкой. На двух из этих внерадикулярных биопленок были обнаружены участки минерализации, похожие на камни (Рис. 8).

Определить то, что данное инфекционное заболевание вызвано биопленками, непросто. Трудности могут быть связаны с несколькими причинами, включая сосуществование биопленочных и планктонных бактерий при многих инфекциях, отсутствие четкого маркера бактерий, образующих биопленки, и потерю фенотипа биопленки при проведении процедур отбора проб и культивирования. Принимая во внимание такие трудности, Парсек и Сингх (23) предложили следующие критерии для определения инфекций, вызываемых биопленками: (1) инфицирующие бактерии прилипают к поверхности или ассоциируются с ней ('ассоциируются' подразумевает, что агрегаты/коагрегаты не обязательно должны быть прочно прикреплены); (2) прямое исследование инфицированной ткани показывает, что бактерии образуют скопления или микроколонии, заключенные во внеклеточный матрикс, который может быть бактериального происхождения или происхождения хозяина; (3) инфекция, как правило, локализуется в определенном месте, и, хотя распространение может иметь место, это вторичное явление; и (4) инфекцию трудно или невозможно искоренить с помощью антибиотиков, несмотря на тот факт, что ответственные за это микроорганизмы подвержены уничтожению в планктонном состоянии. Холл-Стандли и Стандли дополнительно добавили следующий критерий: (5) неэффективное выведение бактерий из организма хозяина, о чем свидетельствует расположение бактериальных колоний в отдельных областях ткани хозяина, связанных с клетками воспаления хозяина. Согласно этому последнему критерию, наличие полиморфноядерных нейтрофилов (ПМЯН) и макрофагов, окружающие скопления бактерий/коагрегаты in situ значительно усиливают подозрение на причастность биопленки к возникновению заболевания. Мы предлагаем следующий шестой критерий: устранение или значительное нарушение структуры биопленки и экологии приводит к ремиссии патологического процесса.

В подавляющем большинстве случаев биопленки непосредственно соприкасались с воспалительными клетками в апикальной части корневого канала, в ответвлениях и перешейках (критерий 5). Критерий 4 в данном исследовании не оценивался, но широко известно, что внутрирадикулярные эндодонтические инфекции не поддаются лечению системными антибиотиками, хотя большинство эндодонтических бактерий чувствительны к применяемым в настоящее время антибиотикам. Проблема системного применения антибиотиков связана с тем фактом, что эндодонтическая инфекция возникает в бессосудистом пространстве с ограниченным доступом к антибиотикам, но признание эндодонтических инфекций биопленочными инфекциями все еще усиливает объяснения неэффективности антибиотиков.

Хотя эти критерии имеют признанные ограничения, предполагается, что они дают общие характеристики, позволяющие рассмотреть роль биопленок в патогенезе определенного заболевания человека. Представленные результаты, свидетельствующие о наличии биопленочных структур в подавляющем большинстве случаев первичного (80%) и послеоперационного (74%) апикального периодонтита, а также наблюдаемые морфологические особенности этих биопленок, по-видимому, соответствуют четырем из шести критериев. Хотя адгезия и прочность сцепления не могут быть измерены методами, использованными в настоящем исследовании, было обнаружено, что бактериальные скопления/коагрегаты, по крайней мере, связаны с поверхностью дентина корневого канала (критерий 1). В подавляющем большинстве образцов были обнаружены бактериальные колонии, заключенные в аморфный внеклеточный матрикс, происхождение которого, однако, определить не представлялось возможным (критерий 2).

Рисунок 6. Боковой резец верхней челюсти с большой периапикальной просвечиваемостью (>5 мм). (а и b) Разрез, сделанный на границе между апикальной и средней третьими зубами, показывает бактериальную биопленку, покрывающую стенки дентина. Дентинные канальцы, расположенные под биопленкой, сильно поражены и колонизированы на различную глубину (модифицированные методы Тейлора Брауна и Бренна, первоначальное увеличение 100 и 400).

Что касается критерия 6, предложенного в этом исследовании, то воздействие лечения на биопленки и то, как они влияют на результат лечения, здесь не оценивалось и ожидает дальнейших исследований в рамках долгосрочного экспериментального плана. Тем не менее, частое наблюдение биопленок в обработанных каналах при заболеваниях после лечения может, по крайней мере, свидетельствовать о том, что существует потенциал для выполнения этого критерия. Апикальная треть корневого канала можно рассматривать как критическую область по патогенетическим и терапевтическим причинам. Это объясняется тем, что бактерии, расположенные в апикальной трети корневого канала зубов при апикальном периодонтите, занимают такое стратегическое положение, что их можно рассматривать как наиболее важные инфекционные агенты, связанные с патогенезом заболевания. Учитывая это, настоящее исследование ограничило изучение распространенности биопленки системой апикальной трети корневых каналов. Очень высокая распространенность внутрирадикулярных биопленок может быть связана с тем фактом, что бактерии в апикальной трети корневого канала образуют передовой фронт инфекции и затем непосредственно воздействуют на воспаленный участок ткани. Воспалительный экссудат просачивается в апикальную треть корневого канала, создавая жидкую фазу и обеспечивая бактерии питательными веществами в виде гликопротеинов и белков. Это может представлять собой оптимальные условия для образования биопленки и помогает объяснить обилие биопленок, наблюдаемых в апикальной трети корневого канала, особенно при первичных эндодонтических инфекциях, при которых необработанный корневой канал может создавать больше пространства для просачивания экссудата и его застоя в канале. В целом, внутрирадикулярные биопленки на 20% чаще встречались в зубах с большими рентгенологическими повреждениями, чем в зубах с небольшими повреждениями. Было обнаружено, что во всех корневых каналах, связанных с очень большими дефектами (>10 мм), имеются внутрирадикулярные биопленки. Крупные очаги поражения были связаны со сложными внутрирадикулярными инфекциями, характеризующимися бактериальными сообществами с повышенным видовым разнообразием и высокой плотностью популяции. Поскольку для того, чтобы апикальный периодонтит развился и стал заметен рентгенологически, требуется время, можно предположить, что большие дефекты представляют собой длительный патологический процесс, вызванный еще более 'старой' внутрирадикулярной инфекцией.

Рисунок 7. (а) Удаление первого премоляра верхней челюсти без лечения с прикреплением очага апикального периодонтита к верхушке корня. Продольный разрез, проходящий приблизительно через центр щечного канала. В апикальном отверстии заметно разрастание гранулематозной ткани (модифицированный метод Тейлора, Брауна и Бренна, оригинальное увеличение в 16 раз). (б) Детальный снимок апикальной трети корневого канала, показывающий бактериальное содержимое. В центре просвета канала можно различить крупные скопления бактерий с высокой плотностью, окруженные аморфным веществом. Пустые пространства - это артефакты (первоначальное увеличение 100). (c и d) Более высокое увеличение верхней и нижней половин хлопьев на рисунке b. Можно различить большое количество переплетающихся нитей, расходящихся по периферии и выступающих в отчетливое внеклеточное пространство. Обратите внимание на совершенно иное расположение популяций бактерий за пределами хлопьев (первоначальное увеличение 400).

Поскольку для того, чтобы апикальный периодонтит развился и стал заметен рентгенологически, требуется время, можно предположить, что большие повреждения представляют собой длительный патологический процесс, вызванный еще более 'старой' внутрирадикулярной инфекцией. При длительном инфекционном процессе у вовлеченных бактерий могло быть достаточно времени и условий для адаптации к окружающей среде и образования зрелого и организованного сообщества биопленок. Тот факт, что инфицированные корневые каналы зубов с крупными поражениями содержат большое количество клеток и разновидностей микроорганизмов, которые почти всегда образуют биопленки, может помочь объяснить давнюю концепцию о том, что на результат лечения может влиять размер поражения. Настоящее исследование показало, что внутрирадикулярные биопленки значительно чаще встречаются в корневых каналах зубов с эпителизированными поражениями (кистами и эпителизированными гранулемами или абсцессами). 93% поражений, демонстрирующих некоторый уровень пролиферации эпителия, были связаны с корневыми каналами, заселенными бактериальными биопленками. Что касается гистопатологического типа поражения, то внутрирадикулярные биопленки были значительно чаще обнаружены в случаях, диагностированных как кисты (95% по сравнению с 69,5% при гранулемах и 83% при абсцессах). Поскольку апикальные кисты развиваются в результате пролиферации эпителия в некоторых гранулемах, разумно предположить, что чем старше очаг апикального периодонтита, тем больше вероятность того, что он превратится в кисту. Как и в случае с зубами с большими дефектами, возраст патологического процесса также может помочь объяснить более высокую распространенность биопленок в сочетании с кистами.

Как и в других исследованиях, бактерии также были обнаружены в просвете основного канала, разветвлениях и перешейках в виде хлопьев и планктонных клеток, либо смешанных с некротизированной тканью пульпы, либо, возможно, взвешенных в жидкой фазе. Бактериальные хлопья в клинических образцах могли образоваться в результате роста клеточных агрегатов в жидкости или же они могли отделиться от биопленок. Хлопья могут обладать многими из тех же характеристик, что и биопленки, и, как предполагается, наряду с планктонными бактериями играют определенную роль в патогенезе острых клинических форм апикального периодонтита.

Экстрарадикулярные бактериальные биопленки были обнаружены только в шести образцах, и, за исключением одного случая, они всегда были связаны с внутрирадикулярными биопленками. Такая низкая распространенность экстрарадикулярных биопленок согласуется с предыдущими исследованиями. Эти данные также свидетельствуют о том, что экстрарадикулярные биопленки обычно сохраняются из-за внутрирадикулярной инфекции. Во всех случаях, когда наблюдалась экстрарадикулярная биопленка, наблюдались клинические симптомы, и три из них были связаны с синусовыми путями. При абсцессах в воспаленной периапикальной ткани можно было увидеть отдельные бактериальные клетки, которые обычно подвергались фагоцитозу ПМЯН(рис. 4а). Эти данные указывают на то, что экстрарадикулярные инфекции в виде биопленок или планктонных бактерий не являются обычным явлением, обычно зависят от внутрирадикулярной инфекции и чаще встречаются в зубах с симптомами.

Способность эндодонтических бактерий организовываться в сообщества биопленок представляет большой терапевтический интерес для эндодонтии. Хотя бактерии, присутствующие в виде хлопьев и планктонных клеток в основном корневом канале, могут быть легко доступны и уничтожены с помощью инструментов и веществ, используемых во время лечения, до бактерий, образующих биопленки, прикрепленных к стенкам канала или расположенных в виде перешейков и ответвлений, определенно труднее добраться. Было замечено, что многие бактерии под биопленкой проникают в дентинные канальцы (рис. 6), что также создает проблему для дезинфекции. Некоторые покрытые биопленкой стенки магистрального канала могут оставаться нетронутыми инструментами, что особенно актуально, когда корневой канал неправильной формы, плоский или овальный в поперечном сечении (рис. 2е и f).

В настоящем исследовании на стенках корневых каналов обработанных зубов были обнаружены остатки биопленки. Это исследование подтвердило, что перешейки, боковые каналы и апикальные разветвления могут быть забиты бактериями, в том числе в обработанных зубах. Предполагается, что инструменты и антимикробные ирриганты не смогут проникнуть в эти области. Даже в том случае, если антимикробные агенты попадают на биопленку, это не гарантирует успешной антимикробной активности, поскольку бактерии, расположенные в биопленках, проявляют повышенную устойчивость к противомикробным препаратам. Морфологическую классификацию биопленок проводили в соответствии с описанием Холла-Студли и др. в обширном обзоре по этому вопросу. Очень похожее определение дано Костертоном в его 'Руководстве по биопленкам'. 'Биопленка - это многоклеточное сообщество, состоящее из прокариотических и/или эукариотических клеток, встроенных в матрицу, состоящую, по крайней мере частично, из материала, синтезируемого сидячими клетками сообщества'.

Рисунок 8. Премоляр верхней челюсти с клинически некротизированной пульпой и свищевым ходом с щечной стороны. При зондировании пародонтальных карманов обнаружено не было. Наибольший диаметр поражения на рентгенограмме был >5 мм. (а и в) После удаления наблюдается образование зубного камня, покрывающего исключительно верхушку корня. Очаг апикального периодонтита не остался прикрепленным к верхушке корня и был удален отдельно. (c) Срез, сделанный в мезиодистальной плоскости, не проходящий через основное отверстие. Наружная апикальная треть покрыта бактериальной биопленкой (модифицированный метод Тейлора Брауна и Бренна, оригинальное увеличение 16). (d) Большее увеличение области, указанной стрелкой вверху слева, в c. Биопленка с высокой плотностью бактерий (первоначальное увеличение 400). e) Увеличение области, указанной стрелкой внизу слева на рисунке c. Плотная биопленка с преобладанием нитевидных морфотипов. Обратите внимание на область, на которой, по-видимому, нет бактериальных клеток, которая, вероятно, может быть очагом кальцификации (первоначальное увеличение в 1000 раз). (f) Увеличенная область показана стрелкой вправо на c. Биопленка минерализована относительно небольшим количеством бактерий (первоначальное увеличение 1000).

Очевидно, что существуют некоторые особенности, связанные с биопленками, такие как дифференциальная генетическая экспрессия и наличие водных и питательных каналов в матрице, которые невозможно оценить с помощью метода, использованного в данном исследовании. Однако биопленки существенно различаются по структуре в зависимости от общих физических, химических и биологических особенностей окружающей среды. Например, в условиях, когда при прохождении жидкости или воздуха сила сдвига невелика, нет необходимости в прочном сцеплении с поверхностью. Обеспечение такого сцепления привело бы к потере энергии для общества. Таким образом, наши морфологические данные подтверждают включение апикального периодонтита в группу заболеваний, вызываемых биопленками. Необходимы дальнейшие исследования для сравнения основных структурных и физиологических особенностей эндодонтических биопленок с другими биопленками, встречающимися в природе.

Хотя на зубах с апикальным периодонтитом наблюдалась очень высокая распространенность биопленок, существует вероятность того, что цифры, представленные в этом исследовании, все еще являются заниженными. Некоторое количество содержимого корневого канала могло быть смыто во время гистологической обработки из-за использования многочисленных химических растворов, а грамотрицательные бактерии иногда могут быть пропущены используемым методом. Даже с учетом этих ограничений, очень высокая распространенность биопленок, о которой сообщается в этом исследовании, указывает на то, что при правильном и скрупулезном выполнении обычные методы обработки парафином и так называемые 'старые' протоколы бактериального окрашивания по-прежнему являются ценными инструментами для изучения бактериальной колонизации системы корневых каналов.

Разумно предположить, что уникальные условия окружающей среды в корневом канале, как ожидается, повлияют на структуру и функционирование биопленки до такой степени, что в результате образуются эндодонтические биопленки с типичными особенностями. Однако, несмотря на ограниченную разрешающую способность, наше исследование не выявило какой-либо специфической морфологической картины эндодонтических биопленок. На самом деле морфология эндодонтической биопленки постоянно различалась у разных людей, и причины этого заслуживают дальнейшего изучения, но, по-видимому, могут быть связаны с различным видовым составом и возникающими в результате взаимодействиями, типом и доступностью питательных веществ, а также временем инфицирования.

В заключение, настоящее исследование выявило очень высокую распространенность бактериальных биопленок в апикальной трети корневых каналах как необработанных, так и пролеченных зубов с апикальным периодонтитом. Структура бактериального сообщества в канале, которое присоединилось к стенкам дентина или, по крайней мере, было связано с ними клетками, заключенными во внеклеточный аморфный матрикс и часто окруженными воспалительными клетками, соответствует приемлемым критериям для включения апикального периодонтита в группу заболеваний, вызванных биопленкой. Морфологическая структура биопленок варьировала от случая к случаю, и не было выявлено какой-либо уникальной закономерности для эндодонтических инфекций. Бактериальные биопленки по-прежнему чаще встречаются в связи с длительными патологическими процессами, включая обширные дефекты и кисты.

ТАБЛИЦА 1. Распространенность внутрирадикулярных биопленок в апикальной трети и экстрарадикулярных биопленок в необработанных зубах и зубах с обработанными корневыми каналами в зависимости от гистопатологического типа апикального периодонтита и клинической картины.

ТАБЛИЦА 2. Распространенность внутрирадикулярных биопленок в апикальной трети необработанных и обработанных каналов зубов с апикальным периодонтитом в зависимости от размера дефекта, определенного рентгенологически.
*Эти образцы также были включены в группу >5 мм.